El Entresuelo hace un repaso por cinco siglos de pintura española, desde el xvi hasta comienzos del xx, y lo hace con ayuda de obras maestras de la Colección. Entre las piezas más destacadas del siglo xvi se encuentran las siguientes: Retrato del Duque de Alba (1549), de Antonis Mor; La Sagrada Familia con el horóscopo de Cristo (hacia 1562-69), de Luis de Morales; el retrato anónimo de La familia de Felipe ii de España (hacia 1583-85); y una selección de obras de Domenikos Theotokopoulos, más conocido como El Greco. De su época de Roma es la Piedad (hacia 1575), y de sus primeros años en Toledo son La Sagrada Familia (hacia 1585) y el retrato Miniatura de un hombre (hacia 1578-80). Y, representando las obras de madurez de El Greco, tenemos San Jerónimo Penitente (hacia 1600) y San Lucas (hacia 1600-05).

Obras del más célebre pintor de España, Diego Rodríguez de Silva y Velázquez, sirven de introducción al Barroco español, con tres retratos que ilustran periodos importantes de su carrera como pintor de cámara de Felipe iv. De sus primeros años en Madrid es el retrato de Gaspar de Guzmán, Conde-Duque de Olivares (hacia 1625-26); seguido de uno de sus trabajos más personales, Retrato de una niña (hacia 1638-44), que data de su época de madurez en la corte; y procedente de su segunda visita a Italia tenemos el retrato de El Cardenal Camillo Astalli Pamphili (hacia 1650-51). Entre los cuadros que se pueden contemplar en el Entresuelo de otros maestros del siglo xvii se incluyen Santa Lucía (hacia 1630) y Santa Rufina (hacia 1635), ambos de Francisco de Zurbarán; San Pablo (1632), de José de Ribera; El hijo pródigo entre los cerdos (hacia 1656-65), de Bartolomé Esteban Murillo; Cristo camino del Calvario (1661), de Juan de Valdés Leal; Virgen de la Inmaculada Concepción (1670), de Juan Carreño de Miranda; y Las exequias de María Luisa de Orleans, Reina de España (1689-90), de Sebastián Muñoz.

La transición de los grandes maestros de la pintura clásica a los modernos que se produjo a finales del siglo xviii y principios del xix se dejar entrever en el retrato de Infanta de España (hacia 1794-95), de Agustín Esteve; así como en los retratos de Manuel Lapeña (1799) y Pedro Mocarte (hacia 1805-06), de uno de los artistas más famosos del país, Francisco de Goya y Lucientes. El retrato romántico de Jean-Auguste-Dominique Ingres (1833), de Federico de Madrazo y Kuntz, y su comparación con las estampas de la vida cotidiana realizadas con pinceladas impresionistas de Árabes subiendo una colina (hacia 1862-63) y Pórtico de la Iglesia de San Ginés (hacia 1868), de Mariano Fortuny Marsal, son representativos de la evolución estilística de la pintura española en el siglo xix. En los últimos decenios del siglo, numerosos artistas norteamericanos peregrinaron a España para estudiar las pinturas de Velázquez. Uno de los más notables fue John Singer Sargent, cuyos viajes por España en 1879 inspiraron El baile español (1879-80), que cierra la selección de obras de artistas decimonónicos.

A renglón seguido, una serie de excepcionales obras de maestros españoles modernos de principios del siglo xx comienza con Joaquín Sorolla y Bastida y tres de sus más célebres escenas de playa, Después del baño (1908), Idilio marino (1908) y el monumental lienzo Bueyes sacando la barca (1903), así como el espléndido retrato de Louis Comfort Tiffany (1911). Quintaesencia del trabajo del pintor tradicionalista vasco Ignacio Zuloaga y Zabaleta son Lucien Bréval en Carmen (1908), que el propio artista saludara como una de sus mejores pinturas, y el interesante retrato de su paisano vasco Miguel de Unamuno (1926). Estampas asimismo representativas del Modernismo catalán son Calvario de Sagunto (1901), de Santiago Rusiñol; La Roser (1909), de Isidre Nonell; y Muchachas de Burriana (1910-11), de Hermengildo Anglada-Camarasa. El repaso se cierra con la obra expresionista Marineros de Castro Urdiales (hacia 1917), de José Gutiérrez Solana, uno de los artistas españoles más singulares del siglo xx.